L’année dernière, nous avons célébré le 50e anniversaire de la publication des premiers articles sur la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Il ne s’agissait pas d’une célébration sauvage avec des masses dans les rues, ni d’une célébration largement célébrée dans les universités, mais plutôt d’une admiration tranquille de la part des acteurs du domaine pour l’une des méthodes fondamentales qui ont fait progresser notre compréhension de nombreux processus à l’échelle moléculaire.
Le FCS a commencé à briller avec la disponibilité des microscopes confocaux dans les années 1990 et a depuis été activement utilisé pour étudier les réactions chimiques, la formation d'agrégats, les mouvements moléculaires dans les cellules et la fixation de molécules aux membranes, pour n'en citer que quelques applications.
En examinant tous ces processus à l’échelle moléculaire, il devient possible d’étudier de nombreux aspects de la physiologie et de la science des matériaux au niveau d’une seule molécule. Grâce à une compréhension approfondie de ces processus, les chercheurs peuvent concevoir des médicaments, découvrir de nouvelles interactions intracellulaires et faire progresser les matériaux d’une manière qui serait autrement impossible ou très difficile.
Nouvelle avancée des scientifiques estoniens
Récemment, une équipe de scientifiques estoniens du Laboratoire de biologie des systèmes (Département de cybernétique, TalTech) a publié une étude qui pourrait révolutionner la façon dont nous analysons les mesures FCS et remédier à l'une des principales faiblesses de cette approche. Ils ont utilisé de puissants outils informatiques initialement conçus pour l’intelligence artificielle, mais au lieu de s’appuyer sur les méthodes de « boîte noire » de l’IA, ils ont appliqué ces outils pour optimiser des modèles transparents basés sur la physique. Leur étude est publiée dans la revue Avancées scientifiques.
Pour expliquer ce qui a été accompli et pourquoi c’est important, nous devons d’abord aborder les bases du FCS. À la base, FCS fonctionne en enregistrant des données à partir d’un très petit volume, environ un femtolitre (un quadrillionième de litre, le plus petit grain de sable dans une piscine olympique).
Dans sa forme classique, le FCS utilise un microscope confocal pour permettre un si petit volume de mesure. Dans un microscope confocal, un laser est focalisé sur l'échantillon, qu'il s'agisse d'une cellule ou d'un autre objet, et le signal est collecté uniquement à partir du très petit volume situé au foyer du laser. Le FCS est appliqué lorsque nous avons très peu de molécules dans ce volume qui peuvent émettre une fluorescence, une propriété qui permet à certaines molécules d'émettre de la lumière lorsqu'elles sont excitées par des photons.
Avec si peu de molécules, le signal devient très bruité. Cependant, il est possible d'associer des augmentations du signal à l'arrivée de molécules dans le volume, à leur modification par des réactions chimiques ou à leur adhérence aux surfaces. En principe, tout ce qui modifie la fluorescence dans ce volume peut être associé à un processus physique, comme un mouvement ou une réaction, et peut être étudié.
Comment fonctionne le FCS ?
Pour développer votre intuition sur le traitement du signal FCS, imaginez que vous vouliez savoir si un caissier d'un magasin travaille plus vite qu'un autre. Une option consiste à n’en laisser travailler qu’un seul et à voir avec quelle rapidité il peut traiter une longue file d’attente de clients. Malheureusement, bien que simple, cette expérience entraînerait un groupe assez important de clients mécontents. L'alternative consiste à faire en sorte que les deux caissiers travaillent pendant les périodes calmes où il y a peu de clients et enregistrent l'heure à laquelle chaque client arrive à la caisse et part.
En vous concentrant uniquement sur le petit espace autour de chaque caissier, vous pouvez déterminer le temps moyen de traitement d'un client et si ces caissiers travaillent à des vitesses différentes. C’est essentiellement ce que fait le FCS avec les molécules : en suivant l’augmentation des signaux de fluorescence (molécules entrant dans le volume d’observation) et la diminution (molécules sortant), le FCS peut déduire les propriétés moléculaires correspondantes, telles que la vitesse à laquelle elles se déplacent.
L'autocorrélation et son problème statistique
Bien que nous puissions suivre les clients assez facilement, travailler au niveau moléculaire crée des problèmes immédiats en raison de la mauvaise qualité du signal. Les molécules n'émettent pas toujours de photons, de nombreux photons sont manqués et des signaux indésirables peuvent interférer, ce qui rend les données très bruyantes. Pour contourner ce problème, FCS mesure rapidement (chaque microseconde) et de manière répétée, collectant de nombreuses données à analyser. Il s’avère qu’un moyen très utile d’extraire quelque chose d’analysable d’un signal aussi bruyant consiste à calculer l’autocorrélation du signal.
Essentiellement, l’autocorrélation vous indique les chances de voir un signal élevé après un certain temps lorsque vous observez un pic de fluorescence. En effet, si une grosse molécule à déplacement lent pénètre dans le volume d’observation, le signal reste élevé jusqu’à ce que cette molécule s’éloigne. En analysant ces autocorrélations, nous pouvons déterminer la vitesse à laquelle les molécules se déplacent.
Au fil des années, le développement du FCS nous a appris à lire les autocorrélations comme une empreinte digitale : elles révèlent si nous observons de simples mouvements moléculaires, des réactions chimiques, des particules de différentes tailles ou des particules qui interagissent les unes avec les autres. Cependant, il existe un problème majeur dans la manière dont nous analysons ces autocorrélations. Le problème est statistique : puisque toutes les valeurs d’autocorrélation proviennent de la même expérience, il ne s’agit pas de mesures véritablement indépendantes.
Pour comprendre cela, imaginez que vous preniez des mesures de température d'une journée toutes les minutes et que vous demandiez : « Dans quelle mesure la température actuelle est-elle similaire à ce qu'elle était il y a 1 heure ? Il y a 2 heures ? Il y a 4 heures ? » Chaque comparaison vous dit quelque chose de réel sur les modèles de température : le modèle révélerait même s'il s'agissait d'une journée ensoleillée ou nuageuse. Mais comme toutes ces mesures de similarité proviennent du même ensemble de données de température, elles ne sont pas statistiquement indépendantes.
En conséquence, vous ne pouvez pas évaluer correctement la fiabilité de vos conclusions : vous pourriez penser que vous disposez de preuves solides d'un phénomène météorologique, mais en réalité, vous ne disposez que de données d'une journée analysées de plusieurs manières. De même, dans le FCS, alors que chaque valeur d'autocorrélation à différents délais révèle de véritables informations sur le comportement moléculaire, elles sont toutes calculées à partir de parties superposées des mêmes données de fluorescence.
Des choix inconfortables
Pour analyser correctement ces autocorrélations, comme l’ont démontré plusieurs groupes de recherche, les expériences devraient être beaucoup plus longues que ce qui est pratique ou même possible. La durée expérimentale est en fin de compte limitée par la quantité d’exposition laser que votre cellule ou autre objet peut supporter, et pour les cellules vivantes, cette durée est assez limitée. Cela crée un choix inconfortable : utiliser FCS de manière incorrecte ou ne pas étudier le système du tout.
Il y a environ six ans, un groupe de recherche aux États-Unis a proposé une approche alternative : supprimer l'autocorrélation de l'analyse et utiliser des modèles mathématiques qui fonctionnent directement avec les données expérimentales bruitées pour extraire les mêmes informations que celles du FCS. Leur objectif était de raccourcir la durée des expériences en nécessitant moins de données. Comme beaucoup d’autres, l’équipe estonienne était très intéressée par cette approche et souhaitait l’appliquer à l’étude du mouvement moléculaire des cellules du muscle cardiaque.
Cependant, il s’est avéré que la mise en œuvre initiale était très lente et, de manière inattendue, très sensible aux suppositions initiales sur les propriétés clés, telles que l’estimation par le chercheur de la luminosité de la molécule. Cette sensibilité pourrait avoir pour conséquence d’arriver à des réponses incorrectes ou de ne trouver aucune réponse. Ainsi, même si l’idée d’analyser directement les données FCS bruitées était très attrayante, d’autant plus que cela éviterait également les problèmes de traitement des données statistiques qui affligent le FCS traditionnel, son application posait de nombreux problèmes pratiques.
FITSA nécessitait plusieurs fois moins de données que FCS
Dans leur étude récente, le groupe estonien a publié une nouvelle méthode basée sur la même idée que celle proposée précédemment : analyser directement le signal de fluorescence, mais surmontant de nombreux problèmes rencontrés lors de la mise en œuvre antérieure. Ils ont démontré que la nouvelle méthode – l’analyse statistique des traces d’intensité de fluorescence (FITSA) – est très robuste et ne nécessite pas de connaissance précise des propriétés moléculaires avant l’expérience.
L’analyse quantitative de la quantité de données nécessaire pour estimer les propriétés moléculaires à l’aide de FITSA par rapport au FCS classique est particulièrement intéressante. Même en utilisant FCS dans son mode incorrect, FITSA nécessitait plusieurs fois moins de données que FCS. Lorsqu'on compare avec le FCS tel qu'il devrait être correctement appliqué, les différences deviennent stupéfiantes : FITSA nécessite 300 à 21 000 fois moins de données que le FCS. En raison de ces énormes différences, FITSA ouvre de nouvelles opportunités pour étudier ces processus avec une rigueur scientifique qui n’était pas possible auparavant.
Les chercheurs envisagent que FITSA et les méthodes basées sur des approches similaires remplaceront les pipelines d’analyse FCS classiques dans toutes leurs applications dans les sciences de la vie et des matériaux. Actuellement, il reste encore de nombreux problèmes pratiques à résoudre, mais ce que FITSA a démontré, c'est que l'analyse directe des données expérimentales présente un avantage majeur. Avec de nouveaux progrès, cela nous permettra d’étudier les environnements moléculaires et les interactions moléculaires de manière beaucoup plus précise.
Les implications pourraient être transformatrices : imaginez être capable de suivre la façon dont les médicaments interagissent avec les cellules malades avec une précision sans précédent, ou de sélectionner rapidement des milliers de nouveaux médicaments potentiels en observant leur comportement moléculaire dans les cellules vivantes. FITSA pourrait permettre aux chercheurs d’étudier des processus cellulaires qui nécessitent des expériences d’une durée prohibitive, révolutionnant potentiellement notre compréhension de tout, des maladies cardiaques au développement de matériaux avancés.
