La technologie ACE permet une amplification du signal hautement multiplexée et sensible pour détecter des protéines dans des cellules individuelles à l'aide d'une analyse par cytométrie de masse en suspension et par imagerie par cytométrie de masse. Cette illustration montre comment les protéines dans les cellules individuelles d'une section de tissu peuvent être quantifiées avec des anticorps renforcés par l'ACE qui s'y lient. Crédit : Su Min Suh/SciStories
ACE, une innovation révolutionnaire ADN-La technologie d'amplification du signal alimentée par l'énergie électromagnétique améliore considérablement la sensibilité de la cytométrie de masse, offrant de nouvelles perspectives sur divers processus biologiques et pathologiques.
Depuis les années 1950, les chercheurs ont recours à la « cytométrie de flux », une technique renommée conçue par Wallace Coulter, pour caractériser divers types de cellules immunitaires dans des études de recherche et des échantillons de sang humain. Cette méthode a considérablement amélioré notre compréhension du développement des cellules immunitaires et a fourni des approches innovantes pour évaluer la santé humaine et diagnostiquer divers cancers du sang. Par la suite, la cytométrie de flux a été étendue à l’analyse d’autres types de cellules également.
Dans la cytométrie de flux traditionnelle, les protéines de surface cellulaire et intracellulaires sont détectées à l'aide de molécules d'anticorps liées à des sondes fluorescentes. Cependant, bien qu'elle offre une sensibilité à cellule unique, cette méthode est limitée dans la détection de protéines multiples par le nombre de fluorophores qui peuvent être clairement distingués dans l'ensemble du spectre de lumière fluorescente.
L'avènement de la « cytométrie de masse » en 2009 a permis la quantification simultanée de 50 protéines dans des cellules individuelles et une analyse plus fine de l'identité et de l'état physiologique des cellules. Dans la cytométrie de masse, les anticorps sont liés à des isotopes non radioactifs d'éléments métalliques. Ces isotopes peuvent être quantifiés dans différents canaux d'un instrument de cytométrie de masse en fonction de leur masse. Cependant, la cytométrie de masse et sa cousine la « cytométrie de masse par image » (IMC), qui est utilisée pour visualiser les protéines cellulaires dans des tranches de tissu intact, ont eu pour prix une sensibilité réduite par rapport à la cytométrie de flux et à la microscopie à fluorescence.
Aujourd'hui, 15 ans plus tard, une collaboration de recherche menée par l'Institut Wyss de l'Université Harvard et incluant également des chercheurs de MIT et l’Université de Toronto ont mis au point une méthode permettant d’améliorer considérablement la sensibilité de la cytométrie de masse et de l’IMC à l’aide de la nanotechnologie de l’ADN. En appliquant une nouvelle technologie d’amplification du signal appelée « Amplification par extension cyclique » (ACE) aux codes-barres ADN liés aux anticorps, ils ont pu amplifier les signaux protéiques produits par les isotopes métalliques liés aux anticorps de plus de 500 fois et détecter simultanément et avec une grande sensibilité plus de 30 protéines différentes.
La nouvelle méthode leur a permis de détecter quantitativement des protéines rares, d'étudier des changements complexes dans les tissus biologiques et d'étudier comment des réseaux entiers de protéines interconnectées qui régulent les fonctions des cellules immunitaires réagissent à la stimulation et aux conditions pathologiques. Appliquée à l'IMC, l'ACE a également permis d'identifier les types de cellules et les compartiments tissulaires dans les coupes histologiques, ainsi que les changements dans l'organisation tissulaire liés à la pathologie de la maladie rénale polykystique. Les résultats sont présentés dans Biotechnologie de la nature.
« L'ACE contribue à combler une lacune cruciale dans l'analyse cytométrique : en améliorant la sensibilité de la cytométrie de masse, elle permet une plate-forme d'analyse de cellule unique qui atteint simultanément une sensibilité élevée, un multiplexage élevé et un débit élevé. Les opportunités qu'elle ouvre pour étudier des cellules individuelles en suspension et des tissus intacts avec des approches hautement multiplexées et sensibles peuvent fournir une compréhension beaucoup plus approfondie des processus biologiques normaux et pathologiques », a déclaré Peng Yin, Ph. D., membre du corps professoral principal du Wyss Institute, qui a dirigé l'étude. Yin est également professeur au département de biologie des systèmes de (HMS).
Plus d'ADN, plus d'isotopes métalliques, plus de sensibilité
Auparavant, Yin et son groupe de l'Institut Wyss ont développé plusieurs technologies d'imagerie alimentées par l'ADN qui peuvent révéler le fonctionnement interne des cellules avec une résolution ultra-élevée au niveau de la molécule unique, ou en visualisant de nombreuses molécules distinctes. ARN et des molécules de protéines dans une seule tranche de tissu. Mais les structures d'ADN créées à l'aide de ces méthodes ne sont pas suffisamment résistantes pour résister aux conditions relativement difficiles utilisées dans la cytométrie de masse.
« L'ACE résout les problèmes de sensibilité actuels de la cytométrie de masse en permettant aux chercheurs d'associer des molécules d'anticorps à un nombre considérablement accru d'isotopes métalliques par rapport à la cytométrie de masse conventionnelle. Cela facilite considérablement la quantification d'une large gamme de protéines à faible abondance, ce qui était difficile avec les approches unicellulaires précédentes », a déclaré le co-premier auteur Xiao-Kang Lun, Ph.D., qui est chercheur postdoctoral dans le groupe de Yin. Lun a collaboré sur le projet avec le co-premier auteur Kuanwei Sheng, Ph.D., qui avait initialement développé l'ACE pour d'autres applications, notamment l'imagerie multiplexée, et qui est également chercheur postdoctoral travaillant avec Yin. « Inspirés par nos travaux antérieurs sur la réaction d'extension d'amorce pour créer des concatémères d'ADN linéaires (plusieurs copies de la même séquence d'ADN liées en série) et la réaction de PCR qui réalise l'amplification par des cycles thermiques synchronisés, nous avons inventé l'ACE pour synthétiser des concatémères linéaires in situ « par le biais de cycles thermiques de manière contrôlable », a déclaré Sheng.
L'ACE crée un échafaudage avec plusieurs sites de liaison pour les « brins détecteurs » courts porteurs d'isotopes métalliques. De plus, en ramifiant la synthèse du brin d'échafaudage, les chercheurs ont pu encore augmenter la sensibilité de la méthode pour la détection de protéines rares. L'ACE linéaire fournit en moyenne une amplification du signal de 13 fois tandis que l'ACE ramifiée permet d'augmenter de plus de 500 fois un signal initialement non amplifié. Pour stabiliser l'ensemble du complexe de séquences ACE et le garder intact pendant l'analyse par cytométrie de masse, ils ont réticulé les courts doubles brins formés entre l'échafaudage et les brins détecteurs ajoutés avec un agent de réticulation chimique. « En suivant cette recette, nous avons conçu un panel de 33 séquences ACE distinctes (orthologues) dont la synthèse n'interfère pas les unes avec les autres, et nous l'avons appliqué à trois types d'analyse entièrement différents », a déclaré Sheng, qui est également chercheur postdoctoral dans l'équipe de Yin.
Un ACE au travail
L'équipe a d'abord utilisé l'ACE pour étudier les transitions des cellules épithéliales en cellules mésenchymateuses et de nouveau en cellules épithéliales. Les transitions épithéliales-mésenchymateuses (EMT) et les transitions mésenchymateuses-épithéliales (MET) se produisent pendant le développement embryonnaire, mais la première en particulier est également réactivée lorsque les tumeurs deviennent invasives et métastatiques. En profilant au total 32 marqueurs épithéliaux et mésenchymateux, des molécules de signalisation et des facteurs de transcription rares dans des cellules cancéreuses du sein de souris uniques plusieurs fois au cours de leur transition de 28 jours d'un état épithélial à un état mésenchymateux et inversement, et en analysant informatiquement les résultats, ils ont pu apporter un nouvel éclairage sur les deux processus. « L'ACE nous a permis de profiler les niveaux de facteurs de transcription en faible abondance simultanément avec des marqueurs reflétant les états physiologiques et de signalisation cellulaires dans des cellules individuelles. « Cela a conduit à une image plus précise de la manière dont les programmes moléculaires dans EMT et MET sont déterminés par des quantités croissantes et décroissantes de facteurs de transcription clés, notamment Zeb-1 et Snail/Slug », a déclaré Sheng.
Dans leur deuxième exemple, ils ont zoomé sur le fonctionnement interne des cellules T individuelles. La stimulation des molécules du récepteur des cellules T (TCR) à leur surface entraîne l'activation d'un réseau complexe de protéines de signalisation intracellulaires. L'analyse de ces réponses de signalisation à la résolution d'une cellule unique a été difficile, également en raison de la petite taille des cellules T. Les protéines individuelles de ce réseau sont activées par des résidus de phosphate qui leur sont attachés par d'autres protéines du réseau généralement appelées kinases. Bon nombre de ces protéines du réseau activées phosphorylent ensuite d'autres protéines du réseau. Cela conduit finalement à des changements dans le comportement des cellules T, par exemple, envers les agents pathogènes ou les cellules cancéreuses. Les chercheurs ont appliqué l'ACE à un panel de 30 anticorps qui se lient spécifiquement à des motifs phosphorylés dans les protéines du réseau TCR ayant des fonctions dans le stress, l'inflammation, la prolifération cellulaire et d'autres réponses. « En utilisant l'analyse par cytométrie de masse améliorée par l'ACE, nous avons capturé des instantanés quantitatifs du réseau TCR en évolution dynamique dans des cellules T humaines primaires individuelles. « Cela nous a permis d'étudier les variations cellulaires individuelles dans le moment et la durée d'événements spécifiques d'activation des cellules T et de révéler comment le réseau est activé à partir de son état fondamental par des signaux extracellulaires », a déclaré Lun.
L’équipe a utilisé le même panel d’anticorps renforcés par l’ACE pour étudier un phénomène connu sous le nom de « paralysie des lymphocytes T induite par une blessure ». Les lymphocytes T qui subissent une blessure dans leur environnement, comme des lésions tissulaires causées par des interventions chirurgicales majeures, deviennent souvent immunosuppresseurs. Pour commencer à comprendre comment le réseau TCR provoque ce phénomène, le groupe de Yin a collaboré avec le co-auteur Michael Yaffe, MD, Ph.D., qui est professeur de sciences David H. Koch et professeur de biologie et d’ingénierie biologique au MIT et qui s’intéresse particulièrement à la façon dont le microenvironnement entourant les sites de lésions tissulaires supprime le système immunitaire. Yaffe a fourni à l’équipe des échantillons de « liquide de drainage postopératoire » (POF) obtenus auprès de patients subissant une intervention chirurgicale. La stimulation des lymphocytes T avec des POF ainsi que de leurs TCR a permis aux chercheurs d’isoler des changements de réseau distincts qui provoquent l’arrêt de la division des lymphocytes T individuels et leur épuisement.
Enfin, ils ont étudié l'utilité de l'ACE également pour l'analyse spatiale des protéines dans des coupes de tissus en utilisant l'IMC en se concentrant sur le rein humain. Le tissu rénal est difficile à analyser par microscopie à fluorescence en raison de sa forte autofluorescence, et par IMC traditionnelle car il manque de sensibilité. Les chercheurs ont développé un panel de 20 anticorps renforcés par l'ACE pour divers marqueurs rénaux et l'ont utilisé pour examiner des sections du cortex rénal dérivées d'un patient atteint d'une maladie rénale polykystique. Cette approche, dans laquelle ils ont collaboré avec le co-auteur Hartland Jackson, Ph.D., professeur à l'Université de Toronto, Canada et expert en imagerie multiplexée, leur a permis d'identifier les différents types de cellules et leur organisation dans les tubules proximaux et distaux du rein, les canaux collecteurs et les glomérules filtrant le sang. « Nous avons découvert de nouvelles caractéristiques spécifiques à la maladie de l'organisation des cellules et des tissus et avons découvert que le marqueur des cellules souches Nestin, qui est également associé aux troubles rénaux, était exprimé de manière très hétérogène dans les glomérules », a déclaré Lun. « Cela pourrait signifier que différentes parties du tissu pourraient traverser simultanément différents stades pathologiques. »
« Cette nouvelle approche de cytométrie de masse développée par l'équipe de Peng Yin et ses collaborateurs démontre une fois de plus la puissance de l'exploitation de la nanotechnologie de l'ADN pour booster une technique existante qui est très pertinente pour les soins cliniques, et pour l'amener à un niveau de sensibilité et de spécificité beaucoup plus élevé. Cette méthode relativement simple conduira à des perspectives entièrement nouvelles sur le fonctionnement des cellules, des tissus et des organes, à la fois en bonne santé et en maladie », a déclaré le co-auteur principal et directeur fondateur de Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., dont le groupe a fourni une expertise essentielle sur la stimulation des cellules T. Il est également le Professeur de biologie vasculaire Judah Folkman au HMS et au Boston Children's Hospital, et le Professeur Hansjörg Wyss d'ingénierie bioinspirée à la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.
Les autres auteurs de l'étude sont Xueyang Yu, Ching Yeung Lam, Gokul Gowri, Matthew Serrata, Yunhao Zhai, Hanquan Su, Jingyi Luan et Youngeun Kim. L'étude a été financée par des subventions du Instituts nationaux de la santé (prix n° ES028374, CA226898, UG3HL145600, UH3CA255133, DP1GM133052, R01GM124401, RF1MH124606 et RF1MH128861) et l'Institut ontarien de recherche sur le cancer.
