Les chercheurs ont développé un microscope d'imagerie 3D à grande vitesse qui peut capturer la dynamique cellulaire détaillée d'un petit organisme entier entier à la fois. La capacité d'imaginer les changements 3D en temps réel sur un grand champ de vision pourrait conduire à de nouvelles perspectives dans la biologie du développement et les neurosciences.
« Les microscopes traditionnels sont limités par la rapidité avec laquelle ils peuvent recentrer ou scanner à travers différentes profondeurs, ce qui rend difficile la capture de processus biologiques rapidement et 3D sans distorsion ni information manquante », a déclaré Eduardo Hirata Miyasaki, qui a effectué le travail dans le laboratoire de Sara Abrahamsson à l'Université de Californie Santa Cruz (UCSC) et est maintenant au Chan Zuckerg Biohub.
« Notre nouveau système étend la technique de microscopie multifocus (MFM) développée qu'Abrahamsson a développée en utilisant un réseau de 25 caméras pour repousser les limites de la vitesse et de l'imagerie volumétrique. Ce saut d'efficacité ouvre la porte à l'étude de petits systèmes de vie en mouvement sans les perturber. »
Dans Opticales chercheurs décrivent leur nouveau microscope, qui combine une optique diffractive avec 25 minuscules caméras pour images de manière synchrone et simultanément à plusieurs profondeurs. Ils démontrent l'imagerie en direct de volumes 3D de 25 plans mesurant jusqu'à 180 x 180 x 50 microns à des vitesses d'acquisition de plus de 100 volumes par seconde.
« Le nouveau microscope, que nous appelons le M25, est particulièrement utile pour l'imagerie de natation C. elegans Worms, un organisme modèle utilisé pour étudier le développement, les neurosciences et la locomotion », a déclaré Hirata Miyasaki.
« Traditionnellement, les scientifiques ne pouvaient voir qu'une partie de l'organisme clairement à tout moment. Avec notre nouveau microscope, il est possible de voir tout le ver se déplacer naturellement en 3D, permettant aux chercheurs d'étudier comment son système nerveux contrôle le mouvement et comment le comportement pourrait changer en réponse à une mutation génétique, à une maladie ou à un traitement médicamenteux. »
Contrôle de la lumière multi-plan
Un élément clé du nouveau microscope est les éléments optiques diffractifs utilisés pour distribuer les différents plans focaux à travers un tableau de 25 caméras. L'optique diffractive utilise des microstructures pour manipuler la lumière, permettant un contrôle de la lumière plus complexe via un composant plus mince et plus léger que les composants optiques traditionnels tels que les prismes.
S'appuyant sur la technique MFM d'origine, les chercheurs ont conçu un réseau multi-focus pour diviser la lumière entrante afin que chaque appareil photo capture la même scène mais avec une profondeur différente. Ils ont également fait des réseaux personnalisés à utiliser devant chaque objectif de caméra pour corriger la dispersion chromatique introduite par le réseau multi-focus.
En remplaçant le prisme traditionnel de correction chromatique, qui était difficile à évoluer au-delà des tableaux 3 × 3, ces réseaux flambés ont permis une bioimagerie haute résolution à haute résolution à grande vitesse dans plus de plans.
Les réseaux sont fabriqués à partir de motifs à l'échelle nanométrique qui nécessitent des outils de fabrication spécialisés. Après avoir utilisé des simulations pour déterminer les conceptions optimales, les chercheurs ont utilisé l'installation de nanofabrication de l'Université de Californie à Santa Barbara pour graver les motifs en verre. Avec le processus de fabrication maintenant établi, ces éléments diffractifs peuvent être reproduits avec précision à des volumes plus élevés.
« L'une des principales innovations du M25 est son utilisation d'une architecture de correction chromatique simplifiée.
« Cette conception optique rationalisée permet non seulement l'imagerie à grande vitesse, mais prend également en charge la compatibilité avec les modalités sans étiquette – un avantage majeur pour des applications comme l'embryologie, où l'imagerie mini-invasive est essentielle. »
Les chercheurs ont également développé de nouveaux logiciels pour relever le défi de la synchronisation et de l'acquisition rapidement de données à partir de 25 caméras différentes simultanément et de les stocker dans un ordinateur.
« Lorsqu'ils sont combinés, les 25 images – toutes acquises simultanément, sans balayage mécanique ni pièces mobiles – forment un instantané 3D complet », a déclaré Hirata Miyasaki. « Parce que cela se produit à grande vitesse, limité uniquement par la vitesse d'acquisition de la caméra et la luminosité de l'échantillon, nous pouvons enregistrer des volumes entiers au fil du temps, permettant des études de dynamique biologique réelle. »
Imagerie accessible et polyvalente
Le microscope M25 peut être utilisé à la fois pour la fluorescence et les modalités sans étiquette, telles que le champ vif et la microscopie de polarisation, qui sont particulièrement utiles pour l'imagerie des systèmes biologiques sensibles sans introduire des colorants ou des étiquettes. Cette compatibilité avec des techniques mini-invasives rend le M25 bien adapté à des applications comme l'embryologie, où la préservation de la physiologie native est essentielle.
Pour valider l'instrument, les chercheurs ont construit un prototype et ont confirmé qu'il pourrait capturer 25 plans focaux distincts et uniformément espacés simultanément, sans distorsion ni chevauchement, par des cibles d'étalonnage d'imagerie.
Ils ont également utilisé le microscope pour image des échantillons biologiques en direct, y compris des organismes modèles communs tels que C. elegans, D. Melanogaster et P. marinus, démontrant l'imagerie 3D en temps réel des organismes en mouvement sans avoir besoin de numérisation ou de compensation de mouvement.
Le système monte sur le port latéral d'un microscope commercial standard. Mis à part l'optique diffractive, elle ne nécessite aucun matériel spécialisé, ce qui le rend plus simple à se répliquer que les systèmes qui reposent sur des prismes personnalisés ou des modifications complexes de chemin de lumière.
Des étapes de fabrication détaillées pour fabriquer les réseaux de correction chromatique et les réseaux multiples utilisés dans le système d'imagerie M25 3D sont disponibles. Ces composants peuvent être fabriqués dans n'importe quel établissement de nanofabrication académique, y compris l'installation de nanofabrication UCSB.
Le moteur d'acquisition et le plugin Napari sont disponibles sur GitHub.
Ensuite, les chercheurs visent à étendre davantage l'échelle et les applications du système. Par exemple, ils prévoient d'utiliser les riches données d'imagerie du système pour former des modèles d'apprentissage automatique qui peuvent identifier les états cellulaires, suivre les comportements dynamiques et détecter les changements liés à la maladie directement à partir des images.
