Bien que la spécificité de l’édition génétique basée sur CRISPR soit très précise et polyvalente, l’efficacité de l’installation de ces modifications a été faible. Dans cet article, le laboratoire Adamson décrit un éditeur principal plus efficace. Crédit : Caitlin Sedwick pour l'Université de Princeton
Les scientifiques de Princeton apportent une amélioration majeure à un outil d’édition génétique basé sur CRISPR appelé « édition principale ».
Après des années d'ingénierie des systèmes d'édition de gènes, les chercheurs ont développé une suite d'outils permettant la modification des génomes dans les cellules vivantes, ce qui s'apparente à une « chirurgie du génome ». Ces outils, y compris ceux basés sur un système naturel connu sous le nom de CRISPR/Cas9, offrent un énorme potentiel pour répondre à des besoins cliniques non satisfaits, comme l'a souligné la récente approbation par la FDA de la première thérapie basée sur CRISPR/Cas9.
Une approche relativement nouvelle appelée « édition principale » permet l’édition génétique avec des résultats exceptionnels. précision et une grande polyvalence, mais présente un compromis critique : une efficacité variable et souvent faible de l'installation d'édition. En d’autres termes, même si les modifications principales peuvent être effectuées avec une grande précision et avec peu de sous-produits indésirables, l’approche ne parvient souvent pas non plus à effectuer ces modifications à des fréquences raisonnables.
Techniques d'édition améliorées
Dans un article paru sous forme imprimée dans le journal Nature le 18 avril, 2024les scientifiques de Princeton, Jun Yan et Britt Adamson, ainsi que plusieurs collègues, décrivent un éditeur principal plus efficace.
Auteurs (de gauche à droite) Brittany Adamson, professeure adjointe de biologie moléculaire et de l'Institut Lewis-Sigler de génomique intégrative ; et Jun Yan, étudiant diplômé du laboratoire Adamson et premier auteur. Crédit : Photo de Britt Adamson par Denise Applewhite, Université de Princeton. Photo de Jun Yan par l'auteur.
Les systèmes d'édition principaux se composent au minimum de deux composants : une version modifiée de l'élément protéique de CRISPR/Cas9 et un élément ribonucléique. acide (ARN) molécule appelée pegRNA. Ces composants fonctionnent ensemble en plusieurs étapes coordonnées : Premièrement, le pegRNA lie la protéine et guide le complexe résultant vers un emplacement souhaité dans le génome. Là, la protéine pique le ADN et, en utilisant une séquence modèle codée sur le pegRNA, « transcrit de manière inverse » une modification dans le génome voisin. De cette manière, les principaux éditeurs « écrivent » des séquences exactes dans l’ADN ciblé.
« L'édition Prime est un outil d'édition du génome incroyablement puissant car il nous donne plus de contrôle sur la manière exacte dont les séquences génomiques sont modifiées », a déclaré Adamson.
Perspectives expérimentales et innovations
Au début de leur étude, Adamson et Yan, un étudiant diplômé du groupe de recherche d'Adamson et du Département de biologie moléculaire, ont estimé que des processus cellulaires inconnus pouvaient faciliter ou entraver l'édition principale. Pour identifier de tels processus, Yan a présenté un plan conceptuel simple : premièrement, il concevrait une lignée cellulaire qui émettrait une fluorescence verte lorsque certaines modifications principales seraient installées. Ensuite, il bloquerait systématiquement l’expression des protéines normalement exprimées dans ces cellules et mesurerait la fluorescence induite par l’édition pour déterminer laquelle de ces protéines a un impact sur l’édition principale. En exécutant ce plan, l'équipe a identifié 36 déterminants cellulaires de l'édition principale, dont un seul, la petite protéine de liaison à l'ARN La, a favorisé l'édition.
« Bien que favoriser l'édition principale ne soit évidemment pas une fonction normale de la protéine La, nos expériences ont montré qu'elle peut grandement faciliter le processus », a déclaré Yan.
Dans les cellules, La est connu pour lier des séquences spécifiques souvent trouvées aux extrémités de petites molécules d’ARN naissantes et protéger ces ARN de la dégradation. L'équipe de Princeton a immédiatement reconnu que les pegRNA déployés dans les premières expériences de Yan contenaient probablement ces séquences exactes, appelées voies polyuridine, car elles constituent un sous-produit typique mais souvent négligé de l'expression des pegRNA dans les cellules. Des expériences ultérieures ont suggéré que de tels pegRNA exploitent par inadvertance l'activité de liaison finale de La à des fins de protection et pour promouvoir l'édition principale.
Développement de la protéine PE7
Motivée par leurs résultats, l'équipe a demandé si la fusion de la partie de La qui lie les séquences de polyuridine à une protéine d'édition principale standard pourrait augmenter l'efficacité de l'édition principale. Ils ont été ravis de constater que la protéine résultante, qu’ils appellent PE7, améliorait considérablement les efficacités d’édition initiale prévues dans toutes les conditions et, lors de l’utilisation de certains systèmes d’édition principale, laissait les fréquences des sous-produits indésirables très basses. Leurs résultats ont rapidement attiré l'attention de collègues intéressés par l'utilisation de l'édition principale dans des cellules humaines primaires, notamment Daniel Bauer du Boston Children's Hospital et de la Harvard Medical School et Alexander Marson de l'Université de Californie à San Francisco. En collaboration avec les scientifiques de ces laboratoires, l'équipe de chercheurs a ensuite démontré que PE7 peut également améliorer l'efficacité de l'édition dans les types de cellules thérapeutiquement pertinents, offrant ainsi une promesse accrue pour de futures applications cliniques.
« Ce travail est un bel exemple de la manière dont une analyse approfondie du fonctionnement interne des cellules peut conduire à des découvertes inattendues susceptibles d'avoir un impact biomédical à court terme », a noté Bauer.
Financement : Le financement de ce travail a été assuré par le Instituts nationaux de la santé (NIH) (R35GM138167, RM1HG009490, T32HG003284, DP2CA239597, UM1HG012660 (subvention de formation Princeton QCB ; NHGRI) et (T32GM007388 subvention de formation Princeton MOL ; NIGMS) ); le programme de bourses Searle ; l'Initiative de catalyse de Princeton ; Fondation CHDI ; université de Princeton; l'Institut Parker pour l'immunothérapie du cancer (PICI) ; le prix Lloyd J. Old STAR du Cancer Research Institute (CRI) ; la Fondation Simons; l'Initiative CRISPR pour guérir le cancer ; l'Institut de l'Arc ; CRUK/NIH (OT2CA278665 et CGCATF-2021/100006) ; Prix Pew-Stewart Scholars pour la recherche sur le cancer ; la Fondation Doris Duke ; le Consortium de recherche collaborative de l'hôpital de recherche pour enfants St Jude ; NHLBI (R01HL150669); le Centre d'excellence coopératif Fred Hutch en hématologie (U54 DK106829); le China Scholarship Council (CSC), sur la base du protocole d'accord d'avril 2015 entre le CSC et l'Université de Princeton ; le NCI (K00CA245718) ; et l'installation de ressources en cytométrie en flux de l'Université de Princeton (NCI-CCSG P30CA072720-5921).
Numéros de subvention : R35GM138167, RM1HG009490, T32HG003284, DP2CA239597, UM1HG012660, T32GM007388, OT2CA278665, CGCATF-2021/100006, U54 DK106829, K00CA245718, -CCSG P30CA072720-5921
Bailleurs de fonds : National Institutes of Health (NIH), Searle Scholars Program, Princeton Catalysis Initiative, CHDI Foundation ; Université de Princeton, Parker Institute for Cancer Immunotherapy (PICI), Cancer Research Institute (CRI), Fondation Simons, CRISPR Cures for Cancer Initiative, Arc Institute, CRUK/NIH, Pew-Stewart, Doris Duke Foundation, St Jude Children's Research Hospital Collaborative Research Consortium, NHLBI, Centre d'excellence coopératif Fred Hutch en hématologie, China Scholarship Council (CSC), NCI.
